BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Anno accademico 2019/2020 - 1° annoCrediti: 8
Lingua di insegnamento: Italiano
Organizzazione didattica: 200 ore d'impegno totale, 130 di studio individuale, 42 di lezione frontale, 28 di esercitazione
Semestre: 1°
Obiettivi formativi
Fornire agli studenti conoscenze teoriche e pratiche delle principali tecniche utilizzate per l’analisi della struttura e la funzione delle biomolecole, dando particolare rilievo alle metodologie che hanno condotto allo sviluppo di nuove discipline come la genomica, la transcrittomica e la proteomica.
Modalità di svolgimento dell'insegnamento
L'insegnamento (6CFU) prevede 42 ore di lezione frontale e 28 ore di esercitazioni in laboratorio. Per le lezioni frontali il docente si avvarrà di presentazioni in power point e di filmati, anche in inglese.
Prerequisiti richiesti
Conoscenze di base di Chimica generale, Chimica organica, Biochimica e Genetica agraria
Frequenza lezioni
Fortemente consigliata
Contenuti del corso
La manipolazione degli acidi nucleici. Southern e Northern blots. Marcatori molecolari ed analisi genomica. PCR qualitativa e quantitativa. Tecniche e vettori di clonaggio. La trasformazione genetica dei procarioti. Preparazione e analisi di genoteche. La tecnologia del DNA microarray e Ibridizzazione sottrattiva. Metodi di sequenziamento degli acidi nucleici. RNAseq. La trasformazione genetica degli eucarioti. Cisgenesis e Intragenesis. Genome editing. Vettori di espressione e proteine di fusione. Il DNA ricombinante nell’industria agroalimentare.
Testi di riferimento
1) Biochimica e biologia molecolare: Principi e Tecniche, Wilson K., Walker J., ed. Raffaello Cortina (ottava edizione).
2) Rao R., Leone A., Biotecnologie e genomica delle piante, Idelson-Gnocchi ed.
3) Articoli scientifici fornitit dal docente
Programmazione del corso
| Argomenti | Riferimenti testi | |
|---|---|---|
| 1 | Generalità su struttura e funzione degli acidi nucleici, replicazione del DNA, le classi di RNA (coding e non-coding), la sintesi proteica. | Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 1 |
| 2 | Le proprietà fisico-chimiche delle basi azotate dei nucleotidi: distribuzione elettronica ed assorbimento della luce; denaturazione e rinaturazione degli acidi nucleici; calcolo del Tm; influenza della composizione in basi e della forza ionica sul Tm | Testo 1: cap 5 |
| 3 | Gli enzimi impiegati nella tecnologia del DNA ricombinante: un’overview. Endonucleasi di restrizione, DNA ligasi, DNA polimerasi (I, II, III, IV e V), frammento di Klenow, trascrittasi inversa, fosfatasi alcalina, trasferasi terminale, metilasi | Testo 1: cap 5 |
| 4 | Isolamento e separazione degli acidi nucleici: Isolamento del DNA da organismi procarioti ed eucarioti. Preparazione di DNA plasmidico. Isolamento dell’RNA totale e purificazione dell’mRNA tramite cromatografia di affinità | Testo 1: cap 5 |
| 5 | Vettori per il clonaggio genico: plasmidi, fagi, cosmidi, vettori BAC e YAC La trasformazione batterica e la selezione dei batteri ricombinanti: selezione con doppio antibiotico ed alfa-complementazione | Testo 1: cap 6 |
| 6 | Elettroforesi degli acidi nucleici in gel di agarosio e di poliacrilamide | Testo 1: cap 5-6-10 |
| 7 | La polymerase chain reaction PCR: principio ed applicazioni. Design di primers, allestimento di una reazione di PCR; Analisi dei prodotti di PCR su gel di agarosio. La RT -PCR. La PCR quantitativa: real time PCR | Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 2 |
| 8 | Southern e Northern blots, dot blots, trasferimento di DNA da placche di lisi fagica. Costruzione di librerie. Isolamento ed identificazione di geni clonati. Cenni sull’utilizzo dei tools bioinformatici di NCBI (ORF finder, BLAST) | Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 2 |
| 9 | Design e marcatura di sonde geniche con metodologie alternative al 32P: sistema biotina-streptavidina, marcatura con digossigenina. Enzimi reporter: fosfatasi alcalina e perossidasi di rafano | Testo 1: cap 14-5-7 |
| 10 | I metodi di sequenziamento del DNA: il metodo dei dideossiribonucleotidi (Sanger), il pirosequenziamento. PCR in emulsione, Bridge PCR. Le piattaforme di Next Generation Sequencing | Testo 1: cap. 5 Testo 2: cap 2 |
| 11 | L’uso del microarray in studi di genomica funzionale e strutturale. L’analisi globale del trascrittoma: RNAseq. Metodi di arricchimento: la ibridizzazione soppressiva sottrativa (SSH) e la microdissezione laser. | Testo 1: cap. 5-6 Testo 2: cap 2 |
| 12 | La trasformazione genetica degli eucarioti. Cisgenesis ed Intragenesis. Genome editing: tecnologia CRISP/cas9. Cenni sui sistemi meganucleasi, nucleasi a dita di zinco e TALEN | Articoli scientifici forniti dal docente |
| 13 | La produzione di proteine da geni clonati: vettori di espressione. Produzione di proteine di fusione (GST-tag, His-tag). | Testo 1: cap. 6-8 Testo 2: cap 2 |
| 14 | Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilamide. La separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico: isoelectrofocusing (IEF). Elettroforesi delle proteine bidimensionale: analisi del proteoma, MALDI-TOF. Proteomica | Testo 1: cap. 6-8 Testo 2: cap 2 |
| 15 | Marcatori molecolari: definizione e classificazione. Cenni sui marcatori RFLP, SSR, RAPD, e SNP. | Testo 2: cap 2 |
Verifica dell'apprendimento
Modalità di verifica dell'apprendimento
L’esame è scritto da svolgersi in due ore di tempo e comprende sei quesiti di cui due a risposta aperta, due con risposte a multiscelta, e due problemi o esercizi sugli argomenti trattati. A ciascun esercizio verrà attribuito un punteggio stabilito, per un totale di 31/30 punti. Il raggiungimento del punteggio 31/30 si traduce con il conferimento della lode
Esempi di domande e/o esercizi frequenti
1. Descrivere una delle tecniche riportate in programma; 2. Disegnare i primers che consentono l'amplificazione di un DNA target; 3. Identificare i frammenti di DNA derivanti da un esperimento di digestione enzimatica con enzimi di restrizione.