METODOLOGIE BIOMOLECOLARI
Anno accademico 2016/2017 - 1° annoCrediti: 8
Organizzazione didattica: 200 ore d'impegno totale, 158 di studio individuale, 42 di lezione frontale
Semestre: 1°
Obiettivi formativi
Fornire agli studenti conoscenze teoriche e pratiche delle principali tecniche utilizzate per l’analisi della struttura e la funzione delle biomolecole, dando particolare rilievo alle metodologie che hanno condotto allo sviluppo di nuove discipline come la genomica, la transcrittomica e la proteomica.
Prerequisiti richiesti
Conoscenze di base di Chimica generale, Chimica organica, Biochimica e Genetica agraria
Frequenza lezioni
Fortemente consigliata
Contenuti del corso
La manipolazione degli acidi nucleici. Southern e Northern blots. Marcatori molecolari ed analisi genomica. PCR qualitativa e quantitativa. Tecniche e vettori di clonaggio. La trasformazione genetica dei procarioti e degli eucarioti. Preparazione e analisi di genoteche. La tecnologia del DNA microarray e Ibridizzazione sottrattiva. RNAseq. Metodi di sequenziamento degli acidi nucleici. Vettori di espressione e proteine di fusione. Mutagenesi. Il DNA ricombinante nell’industria agroalimentare.
Testi di riferimento
1) Biochimica e biologia molecolare: Principi e Tecniche, Wilson K., Walker J., ed. Raffaello Cortina (sesta edizione).
2) Rao R., Leone A., Biotecnologie e genomica delle piante, Idelson-Gnocchi ed.
Programmazione del corso
| * | Argomenti | Riferimenti testi | |
|---|---|---|---|
| 1 | * | Generalità su struttura e funzione degli acidi nucleici, replicazione del DNA, le classi di RNA, la sintesi proteica. | Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 1 |
| 2 | * | Le proprietà fisico-chimiche delle basi azotate dei nucleotidi: distribuzione elettronica ed assorbimento della luce; denaturazione e rinaturazione degli acidi nucleici; calcolo del Tm; influenza della composizione in basi e della forza ionica sul Tm | Testo 1: cap 5 |
| 3 | * | Gli enzimi impiegati nella tecnologia del DNA ricombinante: un’overview. Endonucleasi di restrizione, DNA ligasi, DNA polimerasi (I, II, III, IV e V), frammento di Klenow, trascrittasi inversa, fosfatasi alcalina, trasferasi terminale, metilasi | Testo 1: cap 5 |
| 4 | * | Isolamento e separazione degli acidi nucleici: Isolamento del DNA da organismi procarioti ed eucarioti. Isolamento dell’RNA totale e purificazione dell’mRNA tramite cromatografia di affinità | Testo 1: cap 5 |
| 5 | * | Vettori per il clonaggio genico: plasmidi, fagi, cosmidi, vettori BAC e YAC La trasformazione batterica e la selezione dei batteri ricombinanti: selezione con doppio antibiotico ed alfa-complementazione | Testo 1: cap 6 |
| 6 | * | Elettroforesi degli acidi nucleici in gel di agarosio e di poliacrilamide | Testo 1: cap 5-6-10 |
| 7 | * | Marcatura di sonde geniche con metodologie alternative al 32P: sistema biotina-streptavidina, marcatura con digossigenina. Enzimi reporter: fosfatasi alcalina e perossidasi di rafano | Testo 1: cap 14-5-7 |
| 8 | * | La polymerase chain reaction PCR: principio ed applicazioni. Disegn di primers, allestimento di una reazione di PCR; Analisi dei prodotti di PCR su gel di agarosio. La RT -PCR. La PCR quantitativa: real time PCR | Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 2 |
| 9 | * | Southern e Northern blots, dot blots, trasferimento di DNA da placche di lisi fagica. Costruzione e screening di librerie. Isolamento ed identificazione di geni clonati. Cenni sull’utilizzo dei tools bioinformatici di NCBI (ORF finder, BLAST) | Testo 1: cap 5 Testo 2: cap 2 |
| 10 | * | I metodi di sequenziamento del DNA: il metodo dei dideossiribonucleotidi (Sanger), il pirosequenziamento. PCR in emulsione, Bridge PCR. Le piattaforme di Next Generation Sequencing | Testo 1: cap. 5 Testo 2: cap 2 |
| 11 | * | L’uso del microarray in studi di genomica funzionale e strutturale. L’analisi globale del trascrittoma: RNAseq. Metodi di arricchimento: la ibridizzazione soppressiva sottrativa (SSH) e la microdissezione laser. | Testo 1: cap. 5-6 Testo 2: cap 2 |
| 12 | * | La produzione di proteine da geni clonati: vettori di espressione Produzione di proteine di fusione (GST-tag, His-tag). La mutagenesi sito-diretta | Testo 1: cap. 6-8 Testo 2: cap 2 |
| 13 | Marcatori molecolari: definizione e classificazione. Cenni sui marcatori RFLP, SSR, RAPD, e SNP. | Testo 2: cap 2 | |
| 14 | * | Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilamide. La separazione delle proteine in base al loro punto isoelettrico: isoelectrofocusing (IEF). Elettroforesi delle proteine bidimensionale: analisi del proteoma, MALDI-TOF. Proteomica | Testo 1: cap. 6-8 Testo 2: cap 2 |
N.B. La conoscenza degli argomenti contrassegnati con l'asterisco è condizione necessaria ma non sufficiente per il superamento dell'esame. Rispondere in maniera sufficiente o anche più che sufficiente alle domande su tali argomenti non assicura, pertanto, il superamento dell'esame.
Verifica dell'apprendimento
Modalità di verifica dell'apprendimento
L’esame è scritto.
Esempi di domande e/o esercizi frequenti
1. Descrivere una delle tecniche riportate in programma; 2. Disegnare i primers che consentono l'amplificazione di un DNA target; 3. Identificare i frammenti di DNA derivanti da un esperimento di digestione enzimatica con enzimi di restrizione.